口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌的主要类型，恶性程度高，5年生存率为50%，是一种多阶段渐进恶变的恶性肿瘤，可从正常黏膜-癌前病变-癌演变而来，其中口腔白斑（OLK）是最常见的口腔癌前病变，口腔白斑恶变率可达11.7-23.1% [1,2]。因此，若能在癌前病变阶段施加干预措施，则可有效预防口腔黏膜癌变，提高患者生存率。近年来，以抗PD-1抗体为核心的免疫治疗在全身多种肿瘤治疗中取得重要进展，但在口腔鳞癌中应答率不到20%，提示存在其它免疫逃逸途径[3]。因此，需要对口腔癌变进程中细胞类型和分布的动态变化进行全面的表征，寻找该进程中介导免疫逃逸的关键分子，为口腔鳞癌的治疗提供新的靶点。

2022年8月16日，来自中山大学附属口腔医院的王智教授团队以及北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院的白凡教授团队联合在The Journal of Clinical Investigation杂志发表题为TDO2⁺ myofibroblasts mediate immune suppression in malignant transformation of squamous cell carcinoma的研究论文。该研究采用单细胞多组学技术和体内体外实验，发现TDO2⁺肌成纤维细胞是介导T细胞免疫抑制的关键细胞亚群。

该研究对13例口腔鳞癌组织、3例白斑组织和8例癌旁正常组织进行单细胞测序，并对T细胞进行了V（D）J测序，共获得131702个高质量细胞，最终定义了10个细胞亚群（图1）。

图1: 单细胞测序流程和主要细胞类型

研究发现，随着口腔癌变的进展，CD4⁺ T细胞中静止及活化的调节性T细胞（Tregs）、耗竭CD4⁺ T细胞占比逐渐升高；具有高增殖能力的过渡态CD4⁺ T细胞主要分化为活化的Tregs以及耗竭CD4⁺ T细胞（图2A-D）。此外，研究者发现CD8⁺ T细胞存在终末耗竭、过渡耗竭和前体耗竭CD8⁺ T细胞亚群，并且在癌旁-癌前病变-癌组织中均呈逐渐升高的趋势，前体耗竭及过渡耗竭CD8⁺ T细胞均朝向终末耗竭方向分化（图2E-H）。以上结果显示在口腔癌变过程中CD4⁺及CD8⁺ T细胞均存在表型转换，其中CD4⁺ T细胞主要转换为具有免疫抑制功能的Tregs，而CD8⁺ T细胞则转换为耗竭表型。

图2: 口腔癌变进程中CD4⁺/CD8⁺ T细胞的亚群分布和分化轨迹

为探究肿瘤微环境中基质细胞是否可介导T细胞免疫抑制，研究者对基质细胞进行聚类分群，发现基质细胞中存在2群肌成纤维细胞亚群，两个亚群均呈现在癌旁正常组织中缺失，在癌前病变和癌组织中逐渐增加的特征（图3A-B）。进一步分析发现，其中一个亚群（MF-C1-TDO2，高表达TDO2和CXCL9）同时具有T细胞趋化和色氨酸代谢功能，而另一个亚群（MF-C2-ELN，高表达ELN）则具有基质重塑功能（图3C-G）。通过免疫荧光证实TDO2仅表达于癌组织的a-SMA⁺肌成纤维细胞中（图3F），并且通过多色免疫组化（mIHC）染色证明其主要位于癌巢组织外围（图4A-D）。组织内mIHC染色及体外高内涵成像结果显示该群TDO2⁺肌成纤维细胞具有较强的T细胞趋化功能（图4E-H）。

图3: 口腔癌变进程中肌成纤维细胞的亚群分布、功能差异和分化轨迹

图4: TDO2⁺肌成纤维细胞在口腔癌中的空间分布和体外高内涵成像结果

上述结果显示TDO2⁺肌成纤维细胞位于癌巢外围，并具有强烈的T细胞趋化功能，那么该群细胞是否介导T细胞免疫抑制呢？通过mIHC染色，研究者发现TDO2⁺肌成纤维细胞周围富集更多的Tregs (Foxp3⁺ CD4⁺)和耗竭 CD8⁺ T 细胞（TIM-3⁺ PD-1⁺ CD8⁺）。为进一步探究TDO2⁺肌成纤维细胞对T细胞的影响，研究者利用siRNA对口腔癌组织中分离的肌成纤维细胞进行TDO2基因敲低后，与CD4⁺/CD8⁺ T细胞共培养，结果显示共培养体系中的Tregs和耗竭CD8⁺ T细胞占比均降低，同时CD8⁺ T细胞的杀伤功能增强。采用TDO2抑制剂LM10处理肌成纤维细胞可观察到相似结果。此外，免疫组化染色结果显示肿瘤间质中高丰度TDO2⁺肌成纤维细胞可提示口腔鳞癌患者预后较差（图5）。

图5: TDO2⁺肌成纤维细胞对CD4⁺/CD8⁺ T细胞的抑制作用

研究结果证明，虽然TDO2⁺肌成纤维细胞具有较强的T细胞趋化功能，但是趋化而来的CD4⁺/CD8⁺ T细胞出现明显的免疫抑制状态，提示该群肌成纤维细胞可能在癌巢外围构筑“陷阱”，通过TDO2催化的色氨酸代谢途径，诱导T细胞免疫抑制，促进肿瘤免疫逃逸。该结果可部分解释为何口腔黏膜恶变进程中虽然病损内有大量T细胞浸润，但仍出现PD-1治疗抵抗的原因。

最后，研究者采用4NQO诱导小鼠口腔内自发成瘤，并采用TDO2抑制剂LM10进行体内治疗，结果显示TDO2抑制剂可有效阻止小鼠口腔黏膜白斑恶变（图6）。此外，采用小鼠口腔癌细胞进行小鼠皮下成瘤，证实TDO2抑制剂联合抗PD-1抗体在阻止口腔鳞癌进展中有更好的效果（图7A-B），而在裸鼠身上TDO2抑制剂没有发挥作用（图7C-D），提示TDO2抑制剂介导的抗肿瘤反应呈T细胞依赖性。

图6: TDO2抑制剂可有效阻止口腔黏膜癌变

图7: TDO2抑制剂联合抗PD-1抗体在阻止口腔鳞癌进展中有更好的效果

该研究系统描绘了口腔黏膜癌变进程中T细胞、髓系细胞和中性粒细胞等免疫细胞以及基质细胞的动态变化图谱，并发现在口腔癌巢外周TDO2⁺肌成纤维细胞具有较强的T细胞趋化和抑制功能，通过实验证明抑制该群肌成纤维细胞可有效促进抗肿瘤免疫反应。本研究为口腔鳞癌的免疫逃逸提出了新的机制，为阻断口腔癌的发生发展提供了新的靶点。

图8: TDO2⁺肌成纤维细胞是介导口腔癌中T细胞免疫抑制的关键亚群

中山大学附属口腔医院的王智教授以及北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院白凡教授是本文的共同通讯作者。北京大学BIOPIC、前沿交叉学科研究院的博士研究生胡思梦、中山大学附属口腔医院的卢涣滋博士、谢文强博士和王迪侃博士是本文的共同第一作者。

原文链接：https://www.jci.org/articles/view/157649

参考文献

1.         Chi AC, et al. Oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma--an update. CA Cancer J Clin. 65(5), 401-421(2015).

2.         Yardimci G, et al. Precancerous lesions of oral mucosa. World J Clin Cases. 2(12), 866-872(2014).

3.         Schoenfeld JD, et al. Neoadjuvant nivolumab or nivolumab plus ipilimumab in untreated oral cavity squamous cell carcinoma: a phase 2 open-label randomized clinical trial. JAMA Oncol. 6(10), 1563-1570(2020).