五羟色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）也被称作血清素（serotonin），是一种重要的单胺类信号分子，参与多种生理功能的调节。在中枢神经系统中，5-HT信号的失调与多种脑部疾病相关，如抑郁症、焦虑、成瘾、偏头痛和癫痫等。目前，多种治疗精神疾病的药物靶向5-HT能系统，如5-HT再摄取抑制剂“百忧解”（fluoxetine，氟西汀）已被广泛用于治疗抑郁症。在活体动物中对5-HT动态变化的高时空分辨率检测对深入理解5-HT能系统在各种生理病理过程中的调控规律具有重要意义。

2024年3月5日，北京大学李毓龙实验室在Nature Methods杂志在线发表了题为“Improved green and red GRAB sensors for monitoring spatiotemporal serotonin release in vivo”的研究论文，基于GRAB探针策略（GPCR-Activation Based Sensor）成功开发出了全新的红色5-HT荧光探针和新一代绿色5-HT荧光探针，并通过光纤记录和大视场成像等方式实现了在活体小鼠多脑区、多行为范式下对5-HT和其它信号的同时检测。实现了从“看得见”到“看得清、看得多、看得广”的突破。

待改进的“看得见”：虽然此前已有几款可遗传编码的5-HT绿色探针被报道，一些条件下能够观察活体动物中的5-HT动态变化，但是现有探针反应大小（即荧光亮度变化程度）与亲和力（即与配体的结合能力）两者“鱼与熊掌不可兼得”，灵敏度还有待提升。

李毓龙团队将已有的神经递质探针中的荧光报告模块移植到不同5-HT受体亚型中，通过不断迭代优化开发了新一代的5-HT绿色探针g5-HT3.0和全新的红色探针r5-HT1.0（图1）。

图1. 改进的绿色5-HT探针和全新的红色5-HT探针的开发与刻画

为了以更高的灵敏度“看得清”5-HT的动态变化，g5-HT3.0结合了高亲和力和高反应两个优点。体外平行对比实验表明，相较于亲和力较高的g5-HT1.0，g5-HT3.0的最大反应约是它的6倍，同时保持了较高的亲和力；相较于反应较大的iSeroSnFR，g5-HT3.0在亲和力方面提升了约13000倍，在纳摩尔至毫摩尔数量级的五羟色胺浓度范围内表现出更大的反应。

为了在神经化学信号种类上“看得多”，r5-HT1.0能与其它绿色荧光探针进行双色成像，实现了不同信号的同时检测。本研究在小鼠基底前脑（Basal Forebrain，BF）同时记录了5-HT能神经元轴突的钙活动（绿色GCaMP6s）以及轴突释放的5-HT（红色r5-HT1.0）的动态变化，发现二者存在很高的相关性（图2）。

图2. 光纤双色记录基底前脑的5-HT和5-HT能神经元轴突钙信号

为了在成像区域上“看得广”，本研究结合大视场荧光成像技术和新的g5-HT3.0探针，实现了大尺度、多脑区的5-HT实时监测。首次在小鼠背侧皮层监测到了不同条件下的5-HT释放特征，，如发现了睡眠觉醒周期存在5-HT水平的动态变化，尤其是非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement，NREM）期间的震荡，而同一时刻不同脑区则展现出相对均一的变化（图3）。结合双色成像进一步发现，在癫痫的病理条件下，背侧皮层存在着5-HT“波”的传播，并且5-HT“波”紧随着钙“波”或者内源大麻素“波”进行传播。以上结果展现了5-HT在大脑不同状态下具有空间特异性的调控特征，为深入理解其功能提供了有力的工具。

图3. 睡眠觉醒周期小鼠背侧皮层5-HT的时空动态

视频1. 小鼠癫痫模型中5-HT和钙“波”的传播

视频2. 小鼠癫痫模型中5-HT和内源大麻素“波”的传播

综上，本研究开发了全新的红色5-HT探针和灵敏度大幅提升的绿色5-HT探针，并且使用这些探针研究了不同生理和病理过程中5-HT的时空动态特征，实现了活体动物中5-HT动态监测的突破——即从“看得见”到“看得清”、“看得多”和“看得广”，加深了对5-HT能系统的了解。这些探针也将为相关领域的研究提供强有力的工具，进一步推动新的科学发现与见解的产生。

北京大学生命科学学院李毓龙教授为该论文通讯作者；北京大学生命科学学院邓飞博士（现为深圳湾实验室分子生理学研究所博士后）和万金霞博士为共同第一作者。李毓龙课题组董辉博士（现为上海交通大学松江研究院青年研究员）、赵玉琳博士、冯杰思博士、李雪霖博士、李国川、夏西聚、王艺潘、郑宇、鄢羽岐等对文章做出了重要贡献。该工作得到了清华大学自动化系谢浩博士、庄超玮博士等的通力合作。研究得到了膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金、北京市科委、生命医学峰基金、宋晨枫与高欣欣公益基金会和新基石科学基金会所设立的新基石研究员项目与科学探索奖等机构和经费的大力支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02188-8